Determinació Matèries en Suspensió i Inhibidores

Cada determinació requereix una tècnica diferent.
Per determinar la màteria en suspensió (MES) utilitzarem, sobretot, el filtrat, en canvi, per determinar les materies inhibidores (MI) utilitzarem la luminiscència.

Com realitzar les tècniques? Per a qué i sobre quines mostres serveixen ? Quines precaucions hem de tenir?

MES
Quin és l’objectiu? 

Les MES són les partícules de matèria orgànica i/o inorgànica que es troben en el si de l’aigua.

Determinació de les matèries en suspensió que hi ha a les aigües mitjançant la filtració de la mostra a través d’un  filtre, de fibra de vidre, prèviament tarat i posteriorment assecat  a l’estufa a 105 ± 2 ºC. La diferència de pesada ens dóna el MES.

Abast

Aigües continentals i residuals.

Rang de mesura MES  de 2 mg/l a 500 mg/l.

Rang de treball MES  de 2 mg/l a 5000 mg/l.

Quins aspectes hem de tenir en compte? 

Cal tenir en compte que treballem amb aigües que poden ser potencialment perilloses i/o tòxiques, per això, a més de les bones pràctiques de laboratori, cal prendre les mesures adequades (guants i/o ulleres) per evitar qualsevol contacte amb la mostra i els reactius.

Quins reactius farem servir?

1. Solució de control de 1000 mg/l de caolin: (solució CAOLI_1000)
   Pesar 1000 mg de caolin (reactiu CAOLIN) (H₂Al₂Si₂O₈-H₂O) prèviament assecat en el dessecador  durant 2h, i arrasament  a 1L d’aigua MiliQ.
2. Solució de control de 500 mg/l de caolin: (solució CAOLI_500)
   Fer una dilució ½,  agafar 250 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu d’aigua residual. Es prepara cada vegada.
3. Solució de control de 100 mg/l de caolin: (solució CAOLI_100)
   Fer una dilució 1/10,agafar 50 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu d’aigua residual. Es prepara cada vegada.
4. Solució de control de 500 mg/l de caolin: (solució CAOLI_500C)
   Fer una dilució ½,  agafar 250 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu d’aigua continental. Es prepara cada vegada.
5.  Solució de control de 100 mg/l de caolin: (solució CAOLI_100C)
   Fer una dilució 1/10, agafar 50 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu matriu d’aigua continental. Es prepara cada vegada.
6.  Solució de control de 10 mg/l de caolin: (solució CAOLI_10)
   Fer una dilució 1/100, agafar 5 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu d’aigua continental (per exemple aigua Viladrau). Es prepara cada vegada.
7. Solució de control de 5 mg/l de caolin: (solució CAOLI_5)
   Fer una dilució 1/200, agafar 2,5 ml de la solució 4.1 i arrasament a 500 ml amb una matriu d’aigua continental (per exemple aigua Viladrau). Es prepara cada vegada.
8. Solució de control de 2 mg/l de caolin: (solució CAOLI_2)
   Fer una dilució 1/500 de la solució 4.1 amb una matriu d’aigua continental (per exemple aigua Viladrau).

Quan s’han de preparar els reactius? Quina es la seva caducitat?

La solució de caoli 1000 es prepara el dia que es necessita i té una caducitat d’un mes.
Els reactius fills, es preparen mitjançant la solució mare (Caoli_1000). S’han de preparar el mateix dia que les farem servir i la seva caducitat es d’un dia.

Aspectes clau: L’aigua contiental és aigua doblement desionitzada i l’aigua residual és aigua que arriba desde algunes instal·lacions i no es potable.

Quins aparells necessitem en aquesta determinació?

• Estufa (105ºC)                                                                                                           

  

• Balança analítica
• Pinces
• Filtres (Whattman)
• Pipeta aforada
• Vidres de rellotge
• Rotulador de vidre
• Assecador
• Matràs aforat
• Proveta

Procediment

1. Engegar la bomba de buit
2. Fem el muntatge del Kitasatos i amb un tub ho conectem a la bomba de buit.
3. Comprovem que la balança estugui calibrada correctament, per això hem de fer un tractament:
   Agafar el filtre GFC sobre el vidre de rellotge i es posa a l’estufa per assecar durant 24 h, passat aquest temps es treu i es posa al dessecador per refredar. Abans de pesar situarem el filtre al costat de la balança fins que s’equilibri amb la humitat ambiental. Agafar el filtre i pesar a la balança. Un cop hem pesat el filtre assecat, procedim a possar el filtre amb la cara llisa cap avall, sobre el porta-filtre de l’embut de filtració, posem el got del kitasatos i l’agafem amb unes pinces de fixació.
   Agafem la mostra, la homogenitzem, un cop homogeneïtzada agafem 25mL* amb proveta i ho passem pel filtre, esvandim 3 cops, com a mínim, la proveta. Un cop ha filtrat la mostra treiem el got del kitasatos i agafem el filtre amb les pinces i el deixem sobre el vidre de rellotge, prèviament identificat. Posar el vidre de rellotge a l’estufa un  a mínim 4 h  i un màxim de 24 h a 105 ºC. Treure el filtre i posar en el dessecador per refredar i tornar a pesar a la balança. Abans de pesar situarem el filtre al costat de la balança fins que s’equilibri amb la humitat ambiental.* D’acord amb l’aspecte de la mostra, s’agafa un volum adequat procurant que el resultat estigui entre 5 i 50 mg. Si es molt bruta filtrarem 250 mL, si es molt neta 1000 mL. Tot això també dependrà de la disponibilitat de mostra que tinguem.
4. Preparem el QC, el volum del QC s’agafarà amb pipeta i ho enrassarem en un matrau. Primer filtrem 1L de matriu i després filtrarem el QC.

Com s’expressa el resultat?

EL resultat que s’obté es donen en mg/l, amb un decimal, de matèries en suspensió d’acord amb La fórmula:

MES= ((Pf – Pi)*1000*1000)/ V de la mostra

Èssent Pf; pes final i Pi; Pes inicial.

 

MI
Quin és l’objectiu?

Determinació de les Matèries Inhibidores mitjançant assaig de mesura de la inhibició de la luminiscència que, de forma natural, emeten els bacteris Vibrio fischeri  davant un contaminant.

Abast

Totes les mostres d’aigües continentals i residuals.

El rang de treball és de 2,2 a 460 UT.

El rang de mesura és de 2.2 a 17.8 UT.

Fonament teòric

Es determina la inhibició de la luminiscència produïda pels cultius de bacteris luminiscents (Vibrio fischeri  NRRL B-11177) davant de la mostra problema. En aquest assaig es porta a terme una barreja en una cubeta de la concentració específica (45%) de la mostra a analitzar, o de la mostra diluïda, amb una suspensió bacteriana luminiscent.

El criteri d’avaluació de l’assaig  és la disminució de la luminiscència, mesurada després d’un temps de contacte amb la mostra de 15, 30 minuts, tenint en compte un factor de correcció () que és una mesura dels canvis d’intensitat de la mostra de control durant el temps d’exposició. Els efectes de la inhibició de la mostra d’aigua pot donar-se com EC₅₀, o com UT (Unitats de Toxicitat).

L’assaig es farà al 45% , procurant que el valor de la G= 1 sigui el més pròxim a la concentració mitja, quan la mostra sigui diluïda. També, utilitzant el mateix principi, es pot fer un anàlisis de crivellament (Screening 45%) per identificar les mostres tòxiques (determinació fora d’acreditació).

Quins aspectes hem de tenir en compte? 

Cal tenir en compte que treballem amb aigües que poden ser tòxiques, per això, a més de les bones pràctiques de laboratori, cal prendre les mesures adequades (guants i/o ulleres) per evitar qualsevol contacte amb la mostra o el 3,5 diclorofenol.

Quins reactius farem servir?

1. .- Solució reconstituent (Reconstitution Solution 50 ml. SDI, Part Number: AZF686016) (RECONST_1) es conserva en nevera.
2. Bacteris  Vibrio fischeri. (NRRL B-11177) (R_LIOFMI_1) Bacteri liofilitzat que es compra i es manté congelat entre  -18 i –20 ºC.
3. OAS (Osmotic Adjusting Solution 50 ml. SDI, Part Number: AZF686019) ( solució d’ajust osmòtic) (MOAS_1) es conserva en nevera.
4. Solució diluent   (Diluent 1,0 L. SDI, Part Number: AZF686011) (DIL_MICR_1) es conserva en nevera.
5. Tires de pH tipus indicador universal (Panreac, Merck…)
6. Solució mare de 3,5 diclorfenol (35DCPH_M) d’una concentració de 2 g/l. Pesar 0,1 g de 3,5 diclorfenol (DICLOROFE >99%) i s’enrasa en un matràs de 50 ml amb aigua Milli-Q.
7. Solució filla de 3,5 diclorfenol (35DCPH) d’una concentració de 25 mg/l. S’agafa 0,5 ml de la solució 4.6 i s’enrasa en un matràs de 50 ml amb matriu.

Quan s’han de preparar els reactius? Quina es la seva caducitat?

La solució reconstituent si cal es pot preparar d’acord amb la UNE-EN-ISO 11348-3.
Els bacteris es compren.
OAS  si cal es pot preparar d’acord amb la UNE-EN-ISO 11348-3.
Solució diluent si cal es prepara d’acord amb la UNE-EN-ISO 11348-3.
Solució mare de 3.5 diclorofenol es guarda en envàs topazi en nevera i té una caducitat de 6 mesos.
Solució filla de 3.5 diclorofenol es guarda en envàs topazi en nevera i té una caducitat de 2 mesos.

Quins aparells necessitem en aquesta determinació?

• Equips Microtox
• Agitador
• Pipetes aforades
• Puntes de pipeta
• Matràs
• Cubetes d’un sol ús
• Cronòmetre
• Vas de precipitat
• Balança granataria
• Congelador
• Frigorífic

Procediment

1. Encendre l’equip Microtox
2. Preparar les mostres.
   

   Hem de tenir en compte:Per norma no es modificarà la mostra (tal com diu l’ISO 11348-3 :2009), però si s’ha de fer (per exemple per petició del client) s’indicarà a l’informe. Si el temps previst des de què es rep la mostra fins que s’analitzi supera les 48 hores, s’ha de recollir una alíquota de la mostra i s’ha de congelar tan aviat com sigui possible. S’ha de descongelar la mostra abans d’analitzar-la. Cal deixar-la a la nevera el dia abans sempre que sigui possible o a temperatura ambient el mateix dia de l’anàlisi. Abans d’analitzar es deixa decantar la mostra durant una hora, ja que només s’analitza el sobrenedant, i es pot mesurar el pH amb tires indicadores de pH o mirar els resultats al sample manager, tant de pH com de salinitat o d’altres (són per tenir una orientació per si cal fer una dilució d’inici). Si s’observa anòxia en la mostra la concentració d’oxigen <3 mg/L cal airejar-la mitjançant airejació.
   El temps fins a l’anàlisi no podrà superar els 2 mesos.

   

3. Fem un test  screening al 45%
   Es un test (crivellament o screening al 45%) que permet analitzar un màxim de 14 mostres a la vegada (amb una sola rèplica) i discriminar les potencialment tòxiques de les que no ho són. Totes les mostres que tinguin més d’un 50% d’efecte s’hauran de considerar tòxiques per sobre del límit de quantificació (2,2 UT). Malgrat això, per tenir més garanties, es repetiran mitjançant el test general del 45% totes aquelles que superin el % d’efecte que provoqui una dilució ¼ del QC (QC de 25 mg/l de 3.5 diclorfenol ( que es col·locarà al lloc A-2.
4. Omplir de cubetes (4.5) les posicions de l’equip que faci falta segons el nombre de mostres a analitzar.
5. Fer la barreja de bacteris (4.2) i diluent (4.4) proporcional a 500ml. de Solució Diluent i 10ml. de bacteris. (en el cas de fer 14 tests simultanis mes el blanc 160µl de bacteris amb la pipeta E-5214 o equivalent i 8 ml de diluent amb la pipeta.
6. Transferir amb la pipeta E-5161 o equivalent, 510µl d’aquesta barreja a les cubetes B-1 fins a B-5, D1 a D5 i F1 a F5 segons sigui necessari i esperar 15 minuts abans de començar el test.
7. – Durant aquests 15 minuts posar, amb les pipetes E-5096, E-5097 i E-5143 o equivalents, 200ml. de OAS (4.3) i 2 ml. del QC diluït 1/4 a la cubeta A-2 i de les mostres problema a les cubeta A-3 a A5, C1 a C5 i E1 a E5 i barrejar amb la pipeta.
8. Transferir amb  pipeta (per exemple E-5242) 1000ml. de Solució Diluent (4.4) a la cubeta A-1.
9. Esperar 15 minuts.
10. Prémer Run acute toxicity test, escollir Custom protocols i Screening 45%.
11. Fer constar el número de mostres a analitzar amb un màxim de 14
12. Entrar el ID numèric de les mostres i fer OK.
13. Quan han passat 15 minuts, des de que hem transferit els bacteris, col·locar la cubeta B-1 en la cel·la READ. Prémer SET i esperar que surti la icona de color verd (Ü) que indica que s’ha realitzat l’ajust de luminescència correctament. Prémer READ per comprovar que la lectura és aproximadament de 90 (en cas contrari repetir aquestes últimes dues operacions). Si el resultat és aproximadament 90, prémer el boto Start i fer la lectura inicial (I₀) de les cubetes B-1 a B-5, D1 a D5 i F1 a F5.
14. Després de la lectura I₀ prémer el botó Start i transferir ràpidament 500ml.
15. Esperar per fer les lectures als 15’ tal i com indiqui l’ordinador.
    Guardar l’arxiu amb el test realitzat posar Screening 45% i una referència dels ID numèrics de les mostres

16.Fem el test general al 45%

Es poden realitzar fins a tres assaigs a la vegada. A continuació es detalla com procedir amb una mostra, en cas de fer-ne més d’una, analitzar-les de la mateixa manera però en les fileres C-D i/o E-F:

16.1.Omplir de cubetes (4.5) les posicions de les fileres A i B.

16.2.Fer la barreja de bacteris (4.2) i diluent (4.4) proporcional a 500ml. de Solució Diluent i  10ml. de bacteris. (en el cas de fer mes de tres tests simultanis 160µl de bacteris amb la pipeta E-5214 o equivalent i 8 ml de diluent amb la pipeta E-5242 o equivalent perquè sobri una mica de barreja i les pipetes no agafin aire).

16.3.Transferir amb la pipeta E-5161 o equivalent 510µl d’aquesta barreja a les cubetes B-1 fins a B-5 i esperar 15 minuts abans de començar el test.

16.4.Durant aquests 15 minuts, transferir amb  pipeta (per exemple E-5242) 1000ml. de Solució Diluent (4.4) a les cubetes de A-1 fins a A-4 (a la A-5 no).

16.5.Posar, amb les pipetes E-5096, E-5097 i E-5143 o equivalents, 200ml. de OAS (4.3) i 2 ml. de la mostra problema a la cubeta A-5 i barrejar amb la pipeta.

16.6.Després, transferir 1ml. de la mostra de A-5 a A-4, de A-4 a A-3, de A-3 a A-2, barrejant bé cada vegada (a la A1 no, ja que serà el blanc).

16.7.Eperem 15 minuts

16.8.Prémer Run acute toxicity test, escollir Custom protocols i Basic test 3 mostres o test_QC_15_30’ segons si són mostres normals o volem analitzar el QC,.

16.9.Fer constar el número de mostres a analitzar amb un màxim de 3 (QC i mostres incloses) i fer Ok.

16.10.Entrar el ID numèric de les mostres i fer OK.

16.11.Quan han passat 15 minuts des de que hem transferit els bacteris, col·locar la cubeta B-1 en la cel·la READ. Prémer SET i esperar que surti la icona de color verd (Ü) que indica que s’ha realitzat l’ajust de luminiscència correctament. Prémer READ per comprovar que la lectura és aproximadament de 90 (en cas contrari repetir aquestes últimes dues operacions). Si el resultat és aproximadament 90, prémer el botó Start i fer la lectura inicial (I₀) de les cubetes B-1 a B-5.

16.12. Després de la lectura I₀ prémer el botó Start i transferir ràpidament 500ml. de A-1 a B-1, de A-2 a B-2,…. i de A-5 a B-5. Barrejar.

16.13.Esperar per fer les lectures als 15 i als 30 minuts (segons s’estigui analitzant mostres normals o el QC), tal i com indiqui l’ordinador.

Per guardar l’arxiu amb el test realitzat posar el ID de la mostra i les observacions que calguin (dil., color etc.) i un numerador per si s’ha de repetir el test (-1,-2…). Els informes de les mostres es guardaran amb el test screening 45%.

Com s’expressa el resultat?

Els resultats s’expressen en unitats de toxicitat (UT) amb un decimal a 15, 30 minuts d’acord amb la petició del client. La unitat de toxicitat es calcula segons la següent fórmula:

UT = 100 / EC50