Els clostridis són bacteris de morfologia bacil lar, gram+, anaerobis estrictes (no poden viure en presència d’oxigen). Són capaços de formar espores i el seu metabolisme és sulfit reductor, ja que l’acceptor final d’electrons és l’ió sulfit. Viuen en aigües dolces i en el sòl. També els trobem a l’intestí, però en menor proporció. En formar espores són molt resistents, et pel qual són indicadors d’una contaminació tardana de l’aigua. Són anaerobis perquè acceptor final d’electrons de la seva cadena respiratòria no és l’O2, sinó l’ió sulfit (SO32-), que es redueix a ió sulfur (S2-). Amb producció d’àcid sulfhídric.Per tant s’ha d’impedir de forma estricte el contacte amb l’aire per a assegurar el seu creixement.
Les espores són formes de resistència a al calor, apareixen als 80ºC i són produïdes per dos gèneres de bacteris: els Bacillus i els Clostridium.
Aquest és el bany termoregulable en el qual s’insereixen els tubs d’assaig per assolir la temperatura de 80ºC.
Agar SPS
És el medi de cultiu específic per a clostridis. El medi conté sulfit de sodi (Na2SO3); per a proporcionar als bacteris del seu acceptor final d’electrons. Citrat fèrric (C6H5+4yFexNyO7) que en contacte amb l’àcid sulfhídric forma sulfur de ferro (FeS) que és un precipitat de color negre. La polixina i la sulfadiazina són antibiòtics selectius de bacteris gram–, per tal d’assegurar el creixement de bacteris gram+. Porta també extracte de carn i llevat, com a nutrients.
Colònies de Clostridium. El color negre característic els el proporciona l’anteriorment esmentat FeS.
Objectius
Determinar la presència de clostridis sulfit-reductors a la mostra problema, d’aigua del clavegueram.
Material
- Gradeta
- 4 tubs d’assaig
- Pipeta graduada estèril
- 4 tubs estèrils
- Bany termoregulable
Reactius
- Ringer lactat
- Agar SPS
Procediment
Preparem 4 tubs amb agar SPS. Ho possem 20 minuts a l’autoclau. Es preparen 4 tubs estèrils amb la mostra amb les dilucions pertinents (amb Ringer). Depèn de la concentració esperada podem fer un banc de dilucions mes concentrat o menys concentrat, en el nostre cas, com que esperem una alta concentració (per la pròpia naturalesa de la mostra) fem un banc de dilucions 1/10, 1/100 i 1/1000. Per fer-ho introduïm 9 mL de Ringer en cadascun dels tres tubs d’assaig i en el primer (1/10) afegim amb micropipeta 1 mL, d’aquest primer tub n’agafam 1 mL amb pipeta i el transvasem al segon i d’aquest segon fem el mateix cap al tercer. Col·loquem els tubs en el bany termo-regulable a 80ºC durant uns 5-10 minuts.
Inoculem amb la pipeta graduada estèril 5 mL de la mostra de les anteriors dilucions i realitzem una inoculació anaerobia. Es tracta d’introduir la pipeta fins al fons del tub d’assaig i anar traient mostra a mesura que es va pujant la pipeta (s’ha de fer ràpid abans que solidifiqui l’agar). Un cop s’ha solidificat l’agar, afegim 5 cm més d’agar SPS o una capa de vaselina per a realitzar la capa d’anaerobiosi.
Ja podem posar els tubs a incubar a 37ºC durant 24 hores.
Observacions i Resultats
Si observem colònies de color negre és un indicador de la presencia de clostridis, voldrà dir que el tub és positiu.
Aquesta prova, al nostre grup, alguns tubs no ens van acabar de sortir bé ja que no vam realitzar la capa d’anaerobiosi correctament. Al ser anaerobis estrictes es fa dificultosa la seva sembra.
